Margherita d’Austria nasce il 5 luglio 1522, figlia illegittima di Carlo V, fin da piccolissima si trasferisce nella corte spagnola. Lì vive con sua zia: l’arciduchessa Margherita, di cui porta il nome. Alla sua morte la accudirà la sorella: regina Maria d’Asburgo. Riceverà un’educazione degna di una dama di corte. Nonostante sia nata fuori dal matrimonio, l’Imperatore la riconosce e la userà nell’ottica di una politica matrimoniale molto cara agli Asburgo. Infatti, anche prima che Margherita raggiungesse l’età giusta per il matrimonio Carlo aveva già ben chiaro quale sarebbe stato il suo futuro. La promise in sposa ad Alessandro de Medici, primo duca di Firenze.
Incontra sua padre e il suo futuro marito all’età di 11 anni e raggiunse la corte di Napoli in attesa che arrivi l’età giusta per diventare la Signora De Medici. Margherita d’Austria e Alessandro si sposano il 29 febbraio del 1536. Ma poco dopo suo marito sarebbe morto assassinato, nel 1537. Il governo della città passò a un lontano cugino: Cosimo De Medici, che sperò di poter sposare la giovanissima vedova, ma così non fu. Su indicazione del padre sposerà Ottavio Farnese, nipote dei Papa Paolo III. Nonostante la sontuosa cerimonia organizzata nella cappella Sistina, Margherita non accetta di buon grado la nuova unione. Giunge a Roma con un abito di broccato nero, vestita ancora a lutto, e per diverso tempo alloggia a palazzo Medici, che da quel momento sarà noto come palazzo Madama in onore della Madama d’Austria.
Rifiuterà di convivere con suo marito e di onorare i doveri coniugali. Questi attriti tra i due coniugi ci sono testimoniati da delle lettere tra Margherita e suo padre Carlo V, in cui lei dichiara che un’unione predisposta senza il suo consenso non poteva che essere nulla. Carlo troverà questi argomenti privi di fondamento e dirà a sua figlia che il suo matrimonio è valido e che come tale va onorato. Ma i suoi primi figli nasceranno solamente 7 anni dopo le nozze.
In seguito i rapporti con suo marito si distenderanno, portandola a vivere con lui a Piacenza, avviando la costruzione di Palazzo Farnese, che poi sarà la sua dimora ufficiale.